NAD+/NADH检测试剂盒(比色法)增强灵敏度 15275

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产品型号:15275
 牌:其它品牌
公司名称:西安百萤生物科技幸运飞艇注册
  地:陕西户县
发布时间:2020-08-31
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产品简介

NAD+/NADH检测试剂盒(比色法)增强灵敏度

产品详细信息

Amplite NAD+/NADH检测试剂盒(比色法)增强灵敏度

货号 15275 存储条件 f/l
规格                       400 Tests 价格                           3720
Ex (nm) 460                             Em (nm)                           
分子量
溶剂
产品详细介绍

简要概述

        Amplite 总NAD和NADH检测试剂盒 (比色法)增强灵敏度是美国AAT Bioquest研发的检测总NAD和NADH的试剂盒,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式。 NAD形成NADP,通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定基于监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化。 NAD / NADH和NADP / NADPH测定的短紫外波长使得传统方法具有低灵敏度和高干扰。 AAT Bioquest的Amplite 比色总NAD / NADH检测试剂盒为检测总NAD和NADH提供了一种便捷的方法。系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NAD / NADH。无需从样品混合物中纯化NAD / NADH。酶循环反应显着提高了检测灵敏度。 NADH探针是一种生色传感器,在NADH减少时具有460nm的*大吸光度。 NADH探针的吸收与溶液中NADH的浓度成正比。 Amplite™比色法总NAD和NADH分析试剂盒提供灵敏的分析,可在100μL分析体积中检测低至0。1μM的总NAD / NADH。与试剂盒#15258相比,该试剂盒具有更高的灵敏度。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供**的总NAD和NADP检测试剂盒。


产品说明书

96孔板检测示例

概述

准备NAD / NADH反应混合物(50μL)

加入NADH标准品或测试样品(50μL)

在室温下孵育15分钟至2小时

监测460 nm处的吸光度

注意:在开始实验之前,在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

 

操作步骤

1.准备NADH储备溶液:

将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品(组分C)的小瓶中以制备1mM(1nmol / L)NADH储备溶液。

注意:未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20 ℃。

 

2.准备NAD / NADH反应混合物:

2.1将8 mL NADH探针缓冲液(组分B-II)加入到NAD / NADH回收酶混合物(组分A)的瓶中,并充分混合。

2.2将2 mL NADH探针(组分B-I)加入上述瓶中(来自步骤2.1)并充分混合。

注意:这种NAD / NADH反应混合物足以进行200次分析。未使用的NAD / NADH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。


3.准备NADH标准品的系列稀释液(0至10μM):

3。1将10μL1mMNADH储备溶液(来自步骤1)加入990L PBS缓冲液(pH7。4)中,得到10μM(10pmol / L)NADH标准溶液。

注意:稀释的NADH标准溶液不稳定,应在4小时内使用。

3。2取200μL10M NADH标准溶液(来自步骤3。1)进行1:2连续稀释,得到5,2。5,1。25,0。625,0。313,0。156,0。078和0 M系列稀释的NADH标准品。

3.3如表1和2中所述,将含有NADH标准品和含NAD / NADH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微量培养板中。

注意:根据需要准备细胞或组织样本。


表1:白色/透明底96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

B L                

BL               

TS

TS

NS1

NS1

….

…。

NS2

NS2

                  

                    

NS3

NS3



NS4

NS4



NS5

NS5



NS6

NS6



NS7

NS7



注意:NS = NADH标准,BL =空白对照,TS =测试样品


表2:每个孔的试剂组成

NADH Standard

Blank Control

Test Sample

Serial Dilutions*: 50 μL

PBS: 50 μL

50 μL 

*注意:将连续稀释的NADH标准品(0。078μM至5μM)加入NS1至NS7的孔中,一式两份。 高浓度的NADH(例如,>100μM,*终浓度)将导致饱和信号并使校准曲线非线性。


4.在上清液反应中运行NADH测定:

4.1将50μLNAD/ NADH反应混合物(来自步骤2.2)加入NADH标准品,空白对照和测试样品的每个孔中(参见步骤3.3),使总NAD / NADH测定体积为100μL/孔

注意1:对于384孔板,每孔加入25μL样品和25μLNADH反应混合物。

注意2:根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见,裂解缓冲液(组分D)可用于裂解细胞。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时,避光。

4.3用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。

 

数据分析

        空白孔中的吸光度(仅用PBS缓冲液)用作对照,并从具有NADH反应的那些孔的值中减去。 NADH标准曲线如图1所示。

图1。 Amplite™比色NADP / NADPH比率分析试剂盒用于使用SpectraMax酶标仪(Molecular devices)测量白色/透明96孔微量培养板中的总NADP / NADPH量和NADP / NADPH比率。

A-总NADPH和NADP剂量反应:孵育1小时可检测到低至0。03μM的总NADPH。

B-NADP / NADPH比例:用或不用NADP提取溶液处理等量的NADP和NADPH混合物15分钟,然后在室温下用提取溶液中和。 在460nm读取信号。 NADP / NADPH摩尔比基于图1B中所示的吸光度计算。


附录:使用组分G(NAD / NADH裂解缓冲液)的测试样品制剂

1.植物细胞样品:

用裂解缓冲液以200mg / mL均化,并以2500rpm离心5-10分钟,使用上清液进行测试。


2.细菌样品:

离心收集细菌细胞((10,000 g,0°C,15 min)。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液,将处理后的溶液在室温下保持15分钟。以2500 rpm离心5分钟, 用上清液进行试验。


3.哺乳动物细胞样本:

从平板孔中取出培养基,每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液(或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔),并将处理过的溶液在室温下保持15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟,使用上清液进行测试。


4.组织样品:

称取约20mg组织,用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟,使用上清液进行测定。

 

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